ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）包被細(xì)胞樣本通常涉及細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液的處理，以檢測細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)或胞內(nèi)蛋白。具體步驟如下：
一、細(xì)胞培養(yǎng)上清的處理：
1. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接收集上清液或在2-8°C下以2500rpm離心5分鐘，收集澄清的上清液。
2. 對(duì)于懸浮細(xì)胞，先在2-8°C下以2500rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞，然后用PBS輕輕混勻，再次離心，收集澄清的上清液。
3. 收集的上清液可立即用于檢測，或分裝后在-80°C凍存?zhèn)溆谩?/span>
二、細(xì)胞裂解液的制備：
1. 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS清洗，再加入RIPA裂解液（pH 7.3，不含NP-40，TritonX-100和高濃度DTT）和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30分鐘至1小時(shí)。
2. 貼壁細(xì)胞：吸走上清，用PBS洗三次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，裂解條件同懸浮細(xì)胞。
3. 裂解后，10000rpm離心10分鐘，取上清液立即使用或凍存。
三、ELISA包被：
1. 使用5μg/ml的包被抗原（如BSA偶聯(lián)的小分子抗原）與PH9.6的碳酸鹽緩沖液或PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液混合，加入到微孔板中。
2. 室溫、4°C或37°C下過夜包被，具體溫度根據(jù)抗原穩(wěn)定性選擇。
四、洗滌與封閉:
1. 棄去包被液，用PH7.2-7.4的PBST洗滌三次，每次3-5分鐘。
2. 每孔加入1%BSA、10%小牛血清或5%脫脂奶粉等封閉劑，37°C封閉2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。
六、一抗與二抗的結(jié)合：
1. 加入適當(dāng)稀釋的一抗，孵育1.5小時(shí)。
2. 再次洗滌后，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，孵育1小時(shí)。
七、顯色與讀數(shù)：
1. 加入底物溶液（如TMB），室溫避光顯色10分鐘，加入終止液（2M硫酸）終止反應(yīng)。
2. 使用酶標(biāo)儀讀取450nm的OD值，評(píng)估血清抗體水平。
3. 選擇合適的包被條件（抗原、濃度、溫度）、封閉劑以及孵育時(shí)間是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。此外，包被后應(yīng)進(jìn)行充分洗滌以去除未結(jié)合的物質(zhì)，確保結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。
